La tinción de Gram es una técnica rápida y se utiliza para ver la presencia de bacterias en una muestra de tejido y clasificar las bacterias como Gram positivas o Gram negativas, según las propiedades químicas y físicas de sus paredes celulares. La tinción de Gram se usa casi siempre como el primer paso para diagnosticar una infección bacteriana.
Esta técnica de tinción lleva el nombre del científico danés Hans Christian Gram (1853-1938), quien desarrolló la técnica en 1882 y la publicó en 1884 como técnica para distinguir entre dos tipos de bacterias con síntomas clínicos similares: Streptococcus pneumoniae (también conocido como Streptococcus pneumoniae), neumococos) y la bacteria Klebsiella pneumoniae.
Paso
Método 1 de 3: preparación del portaobjetos de microscopio
Paso 1. Prepárese para trabajar en el laboratorio
Use guantes y un lazo para el cabello largo para evitar la contaminación bacteriana de la muestra que está analizando. Limpie el espacio de trabajo debajo de una campana extractora o en otra área bien ventilada. Verifique el mechero Bunsen y asegúrese de que el microscopio funcione correctamente antes de comenzar.
Paso 2. Esterilizar el portaobjetos de vidrio del microscopio
Si el portaobjetos de vidrio está sucio, lávelo con agua y jabón para eliminar el aceite y la suciedad. Limpie los portaobjetos con etanol, limpiacristales u otro método utilizado por su laboratorio.
Paso 3. Coloque la muestra en el portaobjetos de vidrio
Puede utilizar la técnica de tinción de Gram para ayudar a identificar bacterias en una muestra médica o un cultivo de bacterias que crecen en una placa de Petri. Para obtener mejores resultados, utilice la tinción de Gram en trazos finos de la muestra. Es aconsejable utilizar muestras que tengan menos de 24 horas, ya que las bacterias más viejas pueden haber dañado sus paredes celulares y es posible que no respondan a la tinción de Gram.
- Si usa una muestra de tejido, agregue 1-2 gotas a un portaobjetos de vidrio. Extienda uniformemente sobre el portaobjetos para formar una fina capa de muestra rociada, deslizándola utilizando el borde del otro portaobjetos de vidrio estéril. Déjelo secar antes de realizar el siguiente paso.
- Si está extrayendo bacterias de una placa de Petri, esterilice el asa de inoculación en un mechero Bunsen hasta que brille y luego déjela enfriar. Use el asa para gotear agua esterilizada sobre el portaobjetos, luego esterilice y enfríe nuevamente antes de usarlo para recolectar una pequeña muestra de bacterias. Después de eso, revuelva suavemente.
- Las bacterias preparadas en el caldo deben agitarse nuevamente con un agitador vortex, luego tomarse con el asa de inoculación como se indicó anteriormente, sin agregar agua.
- Si tiene una muestra de hisopo (generalmente hecha con un pequeño mango con punta de algodón), toque y gire suavemente el hisopo sobre el portaobjetos.
Paso 4. Una temperatura ligeramente alta puede hacer un buen frotis
El calor mantendrá las bacterias en la parte superior del portaobjetos, por lo que no se disuelven fácilmente durante el proceso de tinción. Toque el portaobjetos rápidamente dos o tres veces sobre un mechero Bunsen o caliente el portaobjetos sobre un calentador eléctrico de portaobjetos. No sobrecalentar, la muestra puede dañarse. Si está usando un mechero Bunsen, debe ser una llama pequeña pero azul en lugar de una llama anaranjada grande.
Alternativamente, también se puede hacer un frotis con metanol, agregando 1-2 gotas de metanol a un frotis seco, secando el metanol restante en el portaobjetos dejándolo al aire libre. Esta técnica minimiza el daño celular y proporciona un fondo de imagen de diapositiva limpio
Paso 5. Coloque la diapositiva sobre la bandeja para colorear
Las bandejas de tinción están hechas de metal, vidrio o placas de plástico poco profundas con una malla suave que recubre la parte superior. Coloca los portaobjetos encima de estas redes, de modo que el líquido que utilices pueda drenarse en la bandeja.
Si no tiene una bandeja para colorear, puede colocar un portaobjetos en una bandeja de plástico para imprimir cubitos de hielo
Método 2 de 3: Proceso de tinción de Gram
Paso 1. Vierta el líquido violeta cristal sobre el frotis
Utilice una pipeta para rociar una muestra de bacterias con unas gotas de colorante violeta cristal, también conocido como violeta de genciana. Déjelo por 30-60 segundos. El violeta de cristal (KV) se separa en solución acuosa en iones KV + y cloruro (Cl-). Estos iones penetran en las paredes celulares y las membranas celulares de las bacterias gram-positivas y gram-negativas. El ion KV + interactúa con los componentes cargados negativamente de las células bacterianas, dando a las células un color púrpura.
Muchos laboratorios utilizan violeta cristal "Hucker", que contiene oxalato de amonio para evitar la precipitación
Paso 2. Enjuague suavemente el cristal violeta
Incline el portaobjetos y use una botella de lavado para rociar un pequeño chorro de agua destilada o del grifo sobre el portaobjetos. El agua debe correr sobre la superficie del frotis y no debe rociarse directamente sobre el frotis. No aclarar en exceso. Puede eliminar las manchas en bacterias Gram positivas.
Paso 3. Enjuague el frotis con yodo y luego enjuague
Use un gotero para enjuagar el frotis con yodo. Déjelo actuar durante al menos 60 segundos, luego enjuague cuidadosamente de la misma manera que antes. El yodo, en forma de ión cargado negativamente, interactúa con KV + para formar un gran complejo compuesto entre el violeta cristal y el yodo (complejo compuesto CV-I) en las capas interior y exterior de la celda. Este complejo de compuestos retendrá el color violeta del cristal violeta dentro de la célula, en los lugares teñidos.
El yodo es una sustancia corrosiva. Evite la inhalación, la ingestión o el contacto con la piel
Paso 4. Agregue lejía de color, luego enjuague rápidamente
Normalmente se utiliza una mezcla 1: 1 de acetona y etanol para este importante paso, que debe cronometrarse cuidadosamente. Coloque el portaobjetos en un cierto ángulo, luego agregue lejía de color hasta que no se vea más púrpura en el agua utilizada para enjuagar. Por lo general, esto toma menos de 10 segundos, o incluso menos tiempo si el blanqueador contiene una alta concentración de acetona. Detenga este paso inmediatamente, de lo contrario, el tinte también lixiviará cristal violeta de las células grampositivas y negativas, y el proceso de tinción debe repetirse. Enjuague inmediatamente cualquier exceso de decolorante utilizando la técnica anterior.
- Se puede usar acetona pura (95% +) como sustituto. Cuanto más acetona use, más rápido funcionará el blanqueador, por lo que debe prestar más atención a la sincronización.
- Si tiene problemas para controlar el tiempo de este paso, agregue el decolorante de color gota a gota.
Paso 5. Espolvoree el contra tinte sobre el frotis y luego enjuague
Se usa una contratinción, generalmente safranina o fucsina, para aumentar el contraste entre las bacterias gramnegativas y grampositivas, al teñir las bacterias decoloradas (decoloradas), es decir, las bacterias gramnegativas, de color rosa o rojo. Dejar actuar durante al menos 45 segundos, luego enjuague.
La fucsina tiñe intensamente muchas bacterias gramnegativas, como Haemophilus spp y Legionella spp. Este método es bueno para principiantes
Paso 6. Seque el portaobjetos
Puede secarlos al aire libre para que se sequen, o secarlos con papel absorbente que se vende para este propósito. El proceso de tinción de Gram está completo.
Método 3 de 3: Comprobación de los resultados de la coloración
Paso 1. Prepare el microscopio óptico
Coloque el portaobjetos bajo el microscopio. Las bacterias varían mucho en tamaño, por lo que el aumento total requerido variará de 400x a 1000x. Se recomienda un objetivo con aceite de inmersión para obtener una imagen más nítida. Deje caer el aceite de inmersión en el portaobjetos, evitando el movimiento mientras gotea para evitar que se formen burbujas. Mueva el mango de la lente del microscopio para que la lente del objetivo encaje en su lugar y toque el aceite.
La inmersión en aceite solo se puede utilizar en lentes especialmente diseñados, no en lentes "secos"
Paso 2. Intente identificar bacterias gram positivas y gram negativas
Examine el portaobjetos con un microscopio óptico. Las bacterias grampositivas aparecen de color púrpura, porque el cristal violeta está atrapado dentro de la pared celular gruesa. Las bacterias gramnegativas serán de color rosa o rojo, porque el cristal violeta se enjuaga a través de las delgadas paredes celulares, por donde entra el tinte rosa.
- Si la muestra es demasiado espesa, el resultado puede ser un falso positivo. Teñir una nueva muestra si muestra todas las bacterias gram positivas, para asegurarse de que el resultado sea correcto.
- Si usa demasiado blanqueador de color, el resultado puede ser un falso negativo. Teñir una nueva muestra si muestra todas las bacterias gram negativas, para asegurarse de que el resultado sea correcto.
Paso 3. Compare los resultados que ve con la imagen de referencia
Si no sabe cómo se ven las bacterias, estudie la colección de imágenes de referencia, generalmente ordenadas por forma y tinción de Gram. También puede ver bases de datos en línea en [Base de datos nacional de patógenos microbianos, Bacteria in Photos y muchos otros sitios en línea. Para facilitar la identificación, a continuación se muestran ejemplos de bacterias que se encuentran comúnmente o son importantes para el diagnóstico, clasificadas según su estado y forma de Gram.
Paso 4. Identifique las bacterias grampositivas según su forma
Las bacterias se clasifican además de acuerdo con su forma bajo el microscopio, más comúnmente como cocos (esféricos) o varillas (cilíndricas). A continuación se muestran algunos ejemplos de bacterias grampositivas (de color violeta) según su forma:
- Cocos grampositivos generalmente estafilococos (que significa grupo de cocos) o estreptococos (que significa cocos de cadena).
- 'Bacilos grampositivos como Bacillus, Clostridium, Corynebacterium y Listeria. La bacteria bastón Actinomyces spp. Suelen tener ramas o filamentos.
Paso 5. Identifique las bacterias gramnegativas
Las bacterias gramnegativas (de color rosa) a menudo se clasifican en tres grupos. Los cocos son de forma esférica, las varillas son largas y delgadas, mientras que las varillas cocoides están en el medio.
- Cocos gramnegativos La más común es Neisseria spp.
- Bacilos gramnegativos por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas y muchas otras. Vibrio cholerae puede verse como un tallo regular o un tallo doblado.
- Bacterias bacilo gramnegativas "cocoides" (o "cocobacilos") por ejemplo, Bordetella, Brucella, Haemophilus y Pasteurella
Paso 6. Verifique cuidadosamente si los resultados son mixtos
Algunas bacterias son difíciles de colorear con precisión debido a la fragilidad o naturaleza cerosa de sus paredes celulares. Estas bacterias pueden mostrar una mezcla de púrpura o rosa en la misma célula o entre diferentes células en el mismo frotis. Las muestras bacterianas de más de 24 horas pueden mostrar este problema, pero también hay algunas especies bacterianas que siguen siendo difíciles de colorear a cualquier edad de muestreo. Estas bacterias requieren pruebas más especializadas para su identificación, como tinción ácido-resistente, observación en cultivo bacteriano, medios de cultivo TSI o pruebas genéticas.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium y Propionibacterium spp. todas son bacterias grampositivas, pero a menudo no se tiñen claramente.
- Bacterias pequeñas y delgadas como Treponema, Chlamydia y Rickettsia spp. difícil de teñir con el método de Gram.
Paso 7. Deseche los consumibles y equipos restantes
Este procedimiento de eliminación de residuos varía entre laboratorios y depende de los materiales utilizados. Normalmente, el líquido de la bandeja de tinción se desecha en botellas etiquetadas como residuos peligrosos. Remoje los portaobjetos en una solución de lejía al 10% y luego deséchelos en un recipiente para objetos punzantes.
Consejos
- Recuerde que los resultados de la tinción de Gram solo serán buenos si la muestra es buena. Es importante informar a los pacientes para que puedan proporcionar una buena muestra (p. Ej., La diferencia entre escupir y toser profundamente para obtener una muestra de esputo).
- Como blanqueador de color, el etanol reacciona más lentamente que la acetona.
- Cumpla con las regulaciones de laboratorio estándar para garantizar la seguridad.
- Use un hisopo bucal para practicar, ya que contiene bacterias tanto grampositivas como gramnegativas. Si ve solo un tipo de bacteria, es posible que esté usando muy poca o demasiada lejía.
- Puede utilizar cierres de madera para asegurar la diapositiva.
Advertencia
- La acetona y el etanol son sustancias inflamables. La acetona eliminará el aceite de sus manos, facilitando que su piel absorba otros químicos. Use guantes y utilícelos con cuidado.
- No permita que el frotis se seque antes de enjuagar la tinción de Gram o la contratinción.
Que necesitas
- Muestra de red
- Portaobjetos de vidrio
- Pipeta
- Pequeña fuente de fuego, calentador deslizante o metanol
- Agua
- Cristal violeta
- Yodo
- Lejía de color, como alcohol o acetona
- Safranina
